Anticorpo Monoclonal de Coelho Anti-Cas9 para WB, IF/ICC, ELISA - Q99ZW2

Especificações e Parâmetros Principais do Produto

Contexto Biológico: Função e Localização do Cas9

• Cas9 (endonuclease associada ao CRISPR Cas9/Csn1) é uma endonuclease de DNA guiada por RNA de 158,4 kDa que forma o núcleo enzimático do sistema imune adaptativo CRISPR-Cas tipo II em Streptococcus pyogenes. Referências relacionadas: PMID:21455174
• No seu papel biológico nativo, o Cas9 protege as bactérias contra plasmídeos invasores e DNA viral, incorporando sequências estranhas curtas (spacers) nos loci CRISPR, proporcionando uma memória genética para imunidade específica de sequência. Referências relacionadas: PMID:21455174
• O Cas9 requer dois pequenos RNAs — um RNA CRISPR (crRNA) e um crRNA trans-ativador (tracrRNA) — tanto para a ligação ao DNA alvo quanto para a atividade de nuclease; é cataliticamente inativo na ausência destes RNAs guia. Referências relacionadas: PMID:24270795 PMID:24476820
• O reconhecimento do alvo é governado por um motivo adjacente ao protospacer curto (PAM; 5'-NGG-3') dentro da repetição CRISPR, que serve para discriminar o próprio do DNA não próprio; a ligação ao PAM inicia a separação da cadeia de DNA e a formação de heteroduplex. Referências relacionadas: PMID:24476820
• Após o reconhecimento do PAM, o Cas9 catalisa a clivagem endonucleolítica da cadeia alvo não complementar ao crRNA, seguida por um corte exonucleolítico 3'-5'; ambas as etapas de nuclease dependem de íons de magnésio ou manganês. Referências relacionadas: PMID:24476820
• No amadurecimento do RNA CRISPR, o Cas9 não catalisa o processamento; ele estabiliza o duplo pre-crRNA:tracrRNA, permitindo a clivagem precisa pela ribonuclease III do hospedeiro. Referências relacionadas: PMID:24270795

Orientação Experimental e Dicas Técnicas

• O imunogénio abrange os aminoácidos 450-730 do Cas9, uma região que engloba o domínio da nuclease HNH e o domínio de interação com o PAM. Para o western blotting, considere usar lisados de células transfetadas com Cas9 ou Cas9 recombinante de comprimento total purificado como controlo positivo; o peso molecular previsto é de 158 kDa.
• Na imunofluorescência/ICC, a localização do Cas9 pode variar dependendo do RNA guia e do alvo. Valide as condições de fixação e permeabilização com controlos apropriados e confirme a especificidade usando linhagens celulares com Cas9 nocauteado ou com knockdown, se disponível.
• Para ELISA, o fragmento de Cas9 recombinante pode ser usado para estabelecer uma curva padrão; no entanto, avalie a reatividade cruzada com o Cas9 endógeno ou outros membros da família na matriz biológica relevante antes da aplicação quantitativa.
• Este anticorpo tem reatividade cruzada ampla prevista, incluindo com o Cas9 humano. Ao usar amostras de outras espécies, recomenda-se a validação inicial para confirmar a reatividade esperada.

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